不同麻醉肿胀液干预脂肪干细胞的生长增殖与成脂分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (1): 38-43.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.01.006

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不同麻醉肿胀液干预脂肪干细胞的生长增殖与成脂分化

吴立新¹，黎洪棉²，柳大烈³，南华³

1中山大学附属中山医院麻醉科，广东省广州市 528403
2中山大学附属中山医院整形美容外科，广东省广州市 528403

3南方医科大学附属珠江医院整形外科，广东省广州市 510282

收稿日期:2012-04-29 修回日期:2012-05-13 出版日期:2013-01-01 发布日期:2013-01-01
通讯作者: 黎洪棉☆，男，1971年生，广西贺州市人，汉族，2008年南方医科大学毕业，博士，博士后，教授，主任医师，硕士研究生导师，主要从事整形美容外科和干细胞、组织工程与再生医学方面的研究。 binrong2112@163.com
作者简介:吴立新，男，1967年生，汉族，1988年新疆医学院毕业，主任医师，主要从事麻醉学临床与基础研究。 Wlx.1966@163.com
基金资助:
中国博士后科学基金项目(20090450910)；广东省医学科研基金项目(A2011739)；中山市科技计划项目(20113A008)。

Effect of different anesthetic conditions on proliferation and adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells

Wu Li-xin¹, Li Hong-mian², Liu Da-lie³, Nan Hua³

1 Department of Anesthesiology, Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 528403, Guangdong Province, China
2 Department of Plastic and Aesthetic Surgery, Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 528403, Guangdong Province, China

3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Received:2012-04-29 Revised:2012-05-13 Online:2013-01-01 Published:2013-01-01
Contact: M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Plastic and Aesthetic Surgery, Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 528403, Guangdong Province, China binrong2112@163.com
About author:Wu Li-xin, Chief physician, Department of Anesthesiology, Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 528403, Guangdong Province, ChinaWlx.1966@163.com
Supported by:
China Postdoctoral Science Foundation, No. 20090450910*; Medical Research Fund of Guangdong Province, No. A2011739*; Zhongshan Technology Planning Project, No. 20113A008*

摘要/Abstract

摘要：

背景：不同的麻醉肿胀液成分及浓度对脂肪细胞及所获取的人脂肪干细胞的生物学特性是否存在毒性反应等负面影响，至今仍不得而知，国内外亦未见相关研究报道。
目的：观察不同麻醉肿胀液对体外培养条件下人脂肪干细胞增殖与成脂分化的影响，以减少麻醉药物对其损害，提高人脂肪干细胞的利用率。
方法：分离人脂肪干细胞并行原代及传代培养，取P3代细胞以终浓度为0.2 g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液进行干预，并设立对照组。分析人脂肪干细胞受损及生长增殖情况并比较其成脂分化率。
结果与结论：与对照组比较，各麻醉组每个时间点细胞上清液中乳酸脱氢酶值均增高，吸光度值降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)；而布比卡因组与利多卡因组、罗哌卡因组比较，差异也有显著性意义 (P < 0.05)。但各麻醉组人脂肪干细胞成脂分化率与对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。说明终浓度为0.2 g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液对人脂肪干细胞生长增殖有一定的抑制作用，但不影响其成脂分化能力。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 细胞毒性, 细胞增殖, 细胞分化, 麻醉药, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Few reports have reported the effects of anesthetic with different ingredients and concentrations on the biological characteristics of adipocyte and human adipose-derived stem cells, and the negative impacts such as toxic reaction are still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of different anesthetic conditions on the proliferation and adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro in order to reduce anesthetic-induced damage and increase the availability of human adipose-derived stem cells.
METHODS: Human adipose-derived stem cells were isolated from the subcutaneous adipose tissue of healthy adults after liposuction, and primary culture and subculture of human adipose-derived stem cells were conducted. Passage 3 human adipose-derived stem cells were treated with 0.2 g/L of final concentration medium which containing lidocaine, ropivacaine hydrochloride and bupivacaine, respectively. A control group was designated. The damage condition, growth and proliferation of human adipose-derived stem cells were analyzed and the adipogenic differentiation ratio was compared.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the lactate dehydrogenase level of cell supernatants in lidocaine group, ropivacaine group and bupivacaine group at all time points was significantly increased, the absorbance value was decreased, and the difference was significant (P < 0.05); furthermore, there was significant difference in the lactate dehydrogenase level of cell supernatants at all time points between lidocaine group and ropivacaine group or bupivacaine group (P < 0.05). There was no significant difference of adipogenic differentiation ratio of human adipose-derived stem cells between the four groups (P > 0.05). The medium containing lidocaine, ropivacaine hydrochloride and bupivacaine at 0.2 g/L final concentration exhibits the growth and proliferation of human adipose-derived stem cells, but it has no influence on the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.

Key words: stem cells, adipose-derived stem cells, cytotoxicity, cell proliferation, cell differentiation, narcotic, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

吴立新，黎洪棉，柳大烈，南华. 不同麻醉肿胀液干预脂肪干细胞的生长增殖与成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(1): 38-43.

Wu Li-xin, Li Hong-mian, Liu Da-lie, Nan Hua. Effect of different anesthetic conditions on proliferation and adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(1): 38-43.

图/表（结果） 5

2.1 人脂肪干细胞的生物学特性及多向诱导分化经胶原酶消化后的原代细胞培养6 h后开始有少量成纤维细胞样形态的细胞散在贴壁，大部分未贴壁细胞为球形或圆形的血细胞。培养24 h，第1次换液除去未贴壁细胞后，大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，其间也可见少量三角形、多边形细胞。随着培养时间的延长，这些贴壁细胞呈集落状生长，集落大小不一，含数个至数百个细胞不等；集落中细胞形态为典型的梭形细胞。6-8 d可达80%-90%致密层，9-10 d可形成100%融合的致密单层。传代后细胞形态主要为梭形，少数为三角形或多边形，见图1a。传代后细胞生长速度较原代细胞明显增快，如果按1∶3传代，3 d即可长满。连续传代培养15代细胞未出现明显衰老现象。传代后细胞突起明显，呈梭形或多角形，生长较快，经检测本组实验中细胞倍增时间平均约为40 h，各代细胞形态无明显变化，第3代人脂肪干细胞的CD29和CD44免疫荧光染色呈阳性，见图1b，c。

图1 第3代人脂肪干细胞生长呈梭形，细胞表面标志物CD29和CD44免疫荧光染色呈阳性(×100)

Figure 1 Passage 3 human adipose-derived stem cells exhibit a long fusiform morphology, and the immunofluorescence staining of cell surface marker CD29 and CD44 was positive (×100)

成骨诱导3周，可见钙化结节样改变，茜素红染色结节呈红色，见图2a；成软骨诱导2周后，可见高度聚集生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状，结节较大，肉眼可见，阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色，见图2b。

Figure 2 Identification of multipotent differentiation of human adipose-derived stem cells (×100)

图2 人脂肪干细胞多向分化鉴定(×100)

2.2 各种麻醉肿胀液对人脂肪干细胞的毒性作用及生长增殖的影响各实验组人脂肪干细胞经麻醉药干预后的1，3，5，7 d后体外相差显微镜观察，锥虫蓝染色见对照组人脂肪干细胞活力好，极少见蓝染细胞，人脂肪干细胞呈梭形，胞浆丰富，保持了良好的正常形态；而利多卡因、罗哌卡因、布比卡因组细胞活力较弱，可见较多的蓝染细胞，但细胞形态无明显变化。经检测，各实验每个时间点细胞上清液中乳酸脱氢酶活性均较对照组增高，见表1，差异有显著性意义(P < 0.05)。

表1 细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)活性Table 1 Lactate dehydrogenase level in cell supernatants (x(_)±s, U/L, n=24

3种麻醉药均不同程度地降低人脂肪干细胞的增殖能力，各麻醉组细胞培养生长增殖能力明显较对照组减弱，细胞生长平台期较对照组明显延长，培养八九天才能达到平台期，而对照组细胞培养六七天即可达到平台期。XTT检测各组细胞培养1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d时，各实验组各时间点的吸光度值显著低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而布比卡因组的吸光度值又显著低于利多卡因和哌卡因组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

图3 不同麻醉药对人脂肪干细胞生长增殖的影响 Figure 3 Effect of three kinds of anesthetic drugs on the proliferation of human adipose-derived stem cells

2.3 细胞标记后成脂分化率各实验组和对照组人脂肪干细胞向脂肪分化诱导2周后的油红O染色均呈阳性，图4。成脂分化比例分别为(39.4±4.8)%，(43.2±5.2)%，(37.5±4.1)%和(41.7±5.5)%。标记人脂肪干细胞脂肪分化诱导2周后的人脂肪干细胞油红O染色阳性率为(37.9±6.6)%，各实验组与对照组比较，差异无显著性意义(P > 0.05)。

图4 不同麻醉药对人脂肪干细胞成脂分化的影响

Figure 4 Effect of three kinds of anesthetic drugs on the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：于2010年10至12月在南方医科大学实验中心完成。

材料：

脂肪组织：来源于健康成年人吸脂术后的脂肪组织，获取经过供者知情同意并签署了手术知情同意书。实验过程符合医学伦理学标准

方法：

人脂肪干细胞的分离培养与鉴定^[18-19]：取健康成年人吸脂术后的脂肪组织5 mL，PBS反复冲洗后，用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化进行原代细胞分离和接种培养。24 h后换液1次，以后每三四天换液1次。6-8 d细胞生长融合达80%-90%后，经0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3进行传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代人脂肪干细胞形态及生长状况。选取生长良好的第3代细胞制成浓度为1×10⁹ L^-¹细胞悬液待用。取第3代人脂肪干细胞爬片行CD29、CD44的免疫细胞荧光染色并计算CD分子表达呈阳性的细胞比例。取第3代人脂肪干细胞培养生长至培养瓶底100%面积时改用向软骨细胞分化的诱导培养基(含体积分数10%FBS，10 μg/L的转化生长因子β₁，6.25 mg/L的胰岛素，6.25 mg/L的转铁蛋白， s50 μmol/L的磷酸甘油)定向诱导，每2 d更换1次诱导培养基，定向诱导14 d后行阿尔辛蓝染色定性观察诱导分化结果。

麻醉肿胀液干预：将人脂肪干细胞接种至96孔板中，2×10³/孔，待贴壁后吸出原培养基，分别以终浓度为 0.2 g/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因麻醉肿胀液(Sigma公司)进行干预，并设立对照组，仅加入等量普通DMEM培养基，下同，置于37 ℃体积分数5%CO₂孵箱中静置培养。

细胞上清液乳酸脱氢酶活性(LDH值)测定：将对数生长期的人脂肪干细胞接种于96孔细胞培养板, 每孔2×10³个细胞，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱中静置，待细胞贴壁、伸展后各组分别干预1，3，5，7 d后，锥虫蓝排染法观察细胞活性情况，吸取细胞上清液，加入乳酸脱氢酶L试剂，经全自动生化分析仪(波长340 nm)测定乳酸脱氢酶活性值，每个时间段检测24个孔(n=24)，取平均值。

细胞生长曲线XTT法测定^[20]：将对数生长期的人脂肪干细胞接种于96孔细胞培养板, 每孔2×10³个细胞，置于37 ℃、体积分数为5%的CO₂孵箱中静置，各组分别于培养后1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d时，加入5 g/L XTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃原培养液，加DMSO150 μL，持续振荡10 min，酶标仪490/630 nm检测各时间点吸光度后绘制细胞生长曲线图。

细胞成脂能力检测：各组人脂肪干细胞生长至培养瓶底70%-80%面积时，改用向脂肪细胞分化的诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛，0.5 mmol/L异丁基甲基黄嘌呤)定向诱导，其间每两三天更换1次诱导培养基，诱导第6天后按半量换液，定向分化诱导2周后进行油红O染色(用PBS漂洗后使用体积分数10%甲醛固定1 h，室温下使用油红O工作染液孵育5 min，60%异丙醇去除残留染液后蒸馏水多次漂洗)，计算细胞分化比例，即倒置显微镜200倍放大视野下，每孔随机计数5个视野，计算成脂分化细胞占细胞总数的比例，每次平行计数6个孔，计算平均数。

主要观察指标：①细胞上清液乳酸脱氢酶水平。②细胞生长曲线。③细胞成脂分化率。

统计学分析：应用SPSS 11.0统计软件包进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，组间比较及两两比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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